2. 原核蛋白纯化

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原核蛋白提取纯化

His & GST Tag

Buffer Preparation

  • 细菌裂解：1x PBS；1mM PMSF

  • Beads Washing Buffer：1x PBS

  • GST wash Binding Buffer：1x PBS

  • His wash Binding Buffer (pH 7.4 )

    Final 200 mL 500 mL
    NaH2PO4 50 mM 1.56 g 3.1 g
    NaCl 300 mM 3.5 g 8.76 g
    咪唑 Imidazole 5 mM 0.068 g 0.17 g

  • His Elution Buffer

    Final 10 mL 20 mL
    NaH2PO4 50 mM
    NaCl 300 mM
    咪唑 Imidazole 250 mM 0.17 g

  • GST Elution Buffer：

    500μL 1M Tris(8.0)；0.03g GSH；H2O up to 10mL

    Tips:

    • Ni2+ 亲和柱 在pH7-8（中/弱碱性）条件下结合较好，但pH在蛋白等电点附近会不溶。

    • NaCl 用于保持蛋白可溶性/模拟生理条件，常用 150mM; 高盐可降低非特异结合。

    • 惰性蛋白BSA等可增加蛋白稳定性，甘油/PEG可增加缓冲液粘度防止蛋白聚集，少量表面活性剂和离子化合物（硫酸盐/氨基酸/柠檬酸等）可屏蔽蛋白离子相互作用助溶。

    • 蛋白质含有半胱氨酸可能会聚集，5-10mM还原剂（DTT/TCEP/β-ME）可防止。

Steps

  1. 200mL LB培养目的蛋白菌株（BL21等）至OD600=0.6；
  2. 加入5-300 μM IPTG，16℃诱导蛋白 >12h；
  3. 离心收集菌体，重悬于 20mL 细菌裂解液，超声破碎至澄清，4℃离心
  4. 平衡蛋白柱后（1mL Beads），将上清加入柱中4℃孵育 2h；
  5. 滤下裂解液后，用对应 Wash Binding Buffer 洗涤 3-5 次，5min each；
  6. 500 ul Elution Buffer 洗脱3次 5min each，测浓度，甘油保存。