9. 水稻原生质体制备和转化
水稻原生质体制备和转化 Protocol
— edited by Roc_Yan 20221113
Abstract
Rice (Oryza sativa) is an important cereal crop and a model monocot plant for biology research. The reliable system of foreign DNA transformation and expression is a valuable strategy for basic research and molecular breeding application in rice. The Agrobacterium tumefaciens-mediated foreign DNA transformation system was a powerful tool for genetic research. However, it needs a long period to obtain the stable transformants for further analysis and the transformation rate limits in some organism. Protoplasts are plant cells without a cell wall, and it is much easier for foreign DNA transformation and expression. It has been widely applied in transient expression. Here, we describe a simple method for efficient protoplast isolation and transfection in rice.
Buffer 准备及储存
PIB (Protoplast Isolation Buffer)
| Final Conc. | Stock | 100 mL (10 samples) |
|---|---|---|
| 0.6 M Mannitol | 0.8 M | |
| 20 mM MES | 100 mM | |
| 1.5% (w/v) Cellulase R10 | ||
| 0.75% (w/v) Macerozyme R10 | ||
| 10 mM CaCl2 | 0.5 M | |
| 0.1% (w/v) BSA |
- KOH 调节至 pH 5.8，0.22 μm 滤膜过滤，可分装成 10 mL each，-20℃ 保存 6 month。
MMG Buffer
| Final Conc. | Stock | 50 mL |
|---|---|---|
| 0.4 M Mannitol | 0.8 M | |
| 4 mM MES | 100 mM | |
| 15 mM MgCl2 | 0.5 M | |
| 5 mM CaCl2 | 0.5 M |
- KOH 调节至 pH 5.8，0.22 μm 滤膜过滤，可分装成 10 mL each，-20℃ 保存 1 year。
PEG Buffer
| Final Conc. | Stock | 20 mL |
|---|---|---|
| 0.2 M Mannitol | 0.8 M | |
| 100 mM CaCl2 | 0.5 M | |
| 40% (w/v) PEG4000 |
- KOH 调节至 pH 5.8，0.22 μm 滤膜过滤，可分装成 10 mL each，-20℃ 保存 1 year。
W5 Solution
| Final Conc. | Stock | 250 mL |
|---|---|---|
| 2 mM MES | 100 mM | |
| 5 mM KCl | 0.5 M | |
| 154 mM NaCl | 5 M | |
| 125 mM CaCl2 | 0.5 M | |
| 5 mM Glucose | 0.5 M |
- KOH 调节至 pH 5.8，0.45 μm 滤膜过滤，4℃ 保存 6 month。
Methods
Protoplast Isolation (6-8 h)
1）取出 PIB、MMG、PEG buffer，室温溶解，保证组分全部混匀；
2）在培养皿中，将水稻幼苗剪切成约 0.5 mm 小段；
3）快速将切好的材料转移至含有 10 mL PIB 的培养皿中，缓慢吹吸，确保材料充分浸没；
4）在 15–20 inHg（0.05–0.07 MPa）真空设备中，处理 30 min（15 min 摇晃一次）；
5）用 parafilm 封闭培养皿，在 60-80 rpm 条件下，室温孵育 4-8 h，最后 10 min 调节转速至 100 rpm 以加速原生质体释放（反应数越多处理时间要越长）；
6）先用 2 mL W5 浸润 40 μm 细胞筛（多次冲洗，确保细胞筛能流畅过滤）；用 5 mL 移液器，将裂解好的细胞过滤到 50 mL 离心管当中（确保gentle，对原生质体质量很重要）；
7）向剩下的材料中加入 10 mL W5，100 rpm 快速摇晃 1 min，再用 用 5 mL 移液器，将裂解好的细胞过滤到 50 mL 离心管当中；重复一次（总体积 30 mL）；
8）100 g，5 min 室温离心，用移液器吸去上清（可以残留部分上清）；
9）沿着管壁倾斜加入 2 mL W5，轻轻敲击管底重悬细胞，沿着管壁再加入8 mL W5，轻柔混匀，100 g，5 min 室温离心；
10）吸去上清，加入 1 mL W5 重悬细胞，再加入 4 mL W5，轻轻摇晃混匀（这里可以计数，且可以在 26℃ 下，黑暗培养以第二天再使用）；
11）100 g，2 min 室温离心，吸去上清，用 MMG 调节细胞浓度为 2 x 106/mL，可以用 FDA 染色检测原生质体质量；
12）在 MMG 中孵育 1 h 后再用于转化反应。
Transfection and Culture
1）在 2 mL 圆底离心管中加入 30 μL 质粒 DNA（1μg/μL）；
2）缓慢摇晃混匀原生质体，用去尖枪头转移 200 μL（约 4 x 105 细胞数）原生质体，缓慢加入 230 μL PEG，快速且轻柔混匀，黑暗条件下（重要），室温培养 15 - 30 min；
3）向体系中加入 900 μL W5，轻柔颠倒离心管 10 次以上，充分混匀以终止反应；
4）250 g，5 min 室温离心，吸出上清（可残留）；
5）加入 0.5 - 1 mL W5，轻轻吹吸混匀体系；
6）转移到 12 孔培养板中，锡箔纸覆盖，26 - 32℃ 培养 24 - 48h，转化率 ~90%。
Referance：
- Kan Wang and Feng Zhang (eds.), Protoplast Technology: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2464, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2164-6_6, © The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2022；https://link.springer.com/10.1007/978-1-0716-2164-6_6
- Anindya Bandyopadhyay and Roger Thilmony (eds.), Rice Genome Engineering and Gene Editing: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2238, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1068-8_11, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2021；http://link.springer.com/10.1007/978-1-0716-1068-8_11
Tips：
1）进行转化所需的最低浓度为 2 x 105 原生质体/mL，最佳浓度为 2 x 106 原生质体/mL。
2）PEG buffer 需要充分解冻，否则会有针状析出。
3）质粒质量很重要。
4）更高质量的原生质体可以通过 Percoll 梯度离心获得（步骤也很简单），参见 ref.2。